Einfluss prebiotischer Oligosaccharide und probiotischer Bakterien auf den Phänotyp und die Funktion dendritischer Zellen

Neben der Therapie allergischer Erkrankungen, wie dem allergischen Asthma oder der atopischen Dermatitis, nehmen präventive Maßnahmen zur Vermeidung einer Sensibilisierung einen immer höheren Stellenwert ein. Hierbei scheint der Einsatz von Pre- und Probiotika vielversprechend zu sein. rnrnIm Rahmen dieser Dissertation wurde der Einfluss von Pre- und Probiotika auf den Phänotyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierzu wurden unreife DCs aus Vorläuferzellen im Knochenmark von Mäusen differenziert (BM-DCs). Nach Behandlung der Kulturen während der Differenzierung der BM-DCs mit neutrale Humanmilch-analoge Oligosaccharide-enthaltenden Präparationen (NOS-Präparationen) konnte ein Einfluss auf die Zellen nachgewiesen werden; die NOS-Präparationen sind in der Lage, die durch LPS induzierte Ausreifung der BM-DCs zu supprimieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die primärstimulatorische Kapazität LPS-stimulierter BM-DCs, die in Anwesenheit von NOS-Präparationen differenziert wurden, sowohl für allogene als auch für syngene T-Zellen signifikant vermindert war. Die Charakterisierung dieser T-Zellen ergab zwar eine verstärkte Expression des für regulatorische T-Zellen charakteristischen Transkriptionsfaktors FoxP3, auf funktioneller Ebene konnte jedoch keine Induktion von regulatorischen T-Zellen beobachtet werden; allerdings wurde in diesen T-Zellen eine Anergie induziert. Der Befund, dass verschiedene NOS-Präparationen unterschiedliche Wirkungen auf die Differenzierung von BM-DCs aufweisen, muss weitergehend untersucht werden. rnrnWeiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkungen einer Kultivierung der BM-DCs mit den beiden probiotischen Bakterien Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Lactobacillus fermentum analysiert. Hier induzierte ein Kontakt unreifer BM-DCs mit den Bakterien eine Maturierung der Zellen. Das Potential zur Produktion von IL-10 konnte dabei nicht erhöht werden. Im Gegensatz dazu induzierte eine Supplementierung der Kulturen während der Differenzierungsphase der DCs konträre Effekte; die LGG-Gabe resultierte hier in einer unvollständigen Ausreifung der DCs nach LPS-Stimulus. Dies konnte auch auf funktioneller Ebene als stark vermindertes Potential zur T-Zellstimulation bestätigt werden. Inwieweit die Supplementierung mit LGG in tolerogenen DCs resultiert, welche Tregs induzieren können, muss weiter analysiert werden.

Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entzündungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und ermöglichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten können. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer übermäßigen, durch Selektine vermittelten Zelladhäsion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladhäsionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden können. Als Leitstruktur für solche Inhibitoren dient das auf den natürlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der natürlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen natürlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X präsentieren, binden mit deutlich höherer Affinität an die Selektine. Für eine spezifische Rezeptorbindung sind daher außer dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Anknüpfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinitätssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des natürlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verknüpfung zur Neuraminsäure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Adäsionsmolekül an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuraminsäure die (S)-Cyclohexylmilchsäure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verknüpft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika können aus den geschützten Monosacchariden und der geschützten Cyclohexylmilch-säure in parallelen Synthesen im Gramm-Maßstab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparaginsäure vorbeladenen TentaGel®-Harzen durchgeführt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch auflösende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in Kürze auf ihre Wirksamkeit als Zelladhäsions-inhibitoren für E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse über Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Isolierung und Charakterisierung von Spirochaeten aus dem Termitendarm

Termiten beherbergen in ihrem Darm eine einzigartige Flora aus Bakterien, Archaeen, Flagellaten und Hefen. Diese symbiontische mikrobielle Gemeinschaft ist am Abbau von komplexen organischen Verbindungen beteiligt und ermöglicht es den Termiten schwer abbaubares Material wie Holz als Nahrungsquelle zu nutzen. Spirochaeten, eine Gruppe beweglicher Bakterien die sich durch ihre besondere Morphologie und Art der Fortbewegung von allen anderen Mikroorganismen abgrenzen lassen, gehören zu den häufigsten Bakterien im Termitendarm. Ziel der Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung bislang unbekannter Spirochaeten aus Termitendärmen. Aus drei niederen Termitenarten konnten sechs spirochaetale Stämme gewonnen und identifiziert werden. Die Isolate ließen sich anhand der 16S rRNA Gensequenzen den Gattungen Treponema und Spirochaeta zuordnen. Im Gegensatz zu allen bislang charakterisierten Spirochaeten zeigte der Stamm SPN1 aus der Termite Neotermes castaneus eine kokkoide Zellform und war unbeweglich. Der Organismus wurde daher als neue Art, Spirochaeta coccoides sp. nov., beschrieben. Bei allen gewonnenen Isolaten handelt es sich um strikt anaerobe Organismen die verschiedene Mono-, Di- und Oligosaccharide fermentieren. Als wesentliche Stoffwechselprodukte konnten Acetat und Ethanol (sowie Formiat bei einem Stamm) identifiziert werden. Weiterhin konnten bei den untersuchten Stämmen eine Reihe von enzymatischen Aktivitäten nachgewiesen werden, die für den Abbau von Lignocellulose im Termitendarm von Bedeutung sind. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Spirochaeten eine wichtige Rolle bei der Fermentation von Abbauprodukten der Lignocellulose im Termitendarm spielen.

Synthese potentieller Antitumorvakzine aus tumorassoziierten Glycopeptiden des Mucins MUC1 und Versuche zur Festphasensynthese von Oligosacchariden

Festphasenoligosaccharidsynthesen: Um den mit der Synthese der Saccharidbausteine verbundenen Zeitaufwand zu reduzieren, sollten festphasenunterstützte, leicht automatisierbare Strategien entwickelt werden. Für die Optimierungen ist es notwendig, über Analysetechniken zu verfügen, die eine quantitative Verfolgung des Reaktionsablaufes erlauben. Zur Bestimmung der Konzentration freier Hydroxylgruppen wurde hierbei eine einfache und effiziente Reaktionsabfolge gefunden, die eine UV-spektroskopische Analyse erlaubt. rnZur Verknüpfung zwischen Kohlenhydrat und polymerem Träger (Polystyrol, Tentagel) kamen der PTMSE-, ein p-Alkoxybenzyl- und zwei Alkylthioanker zum Einsatz. Die Bedingungen zur Anknüpfung der mit Carboxylgruppen ausgestatteten Anker über Amidbindungen an das Harz, zur Spaltung der Lävulinoylschutzgruppe, sowie zur reduktiven Öffnung der Benzylidenacetalschutzgruppe wurden optimiert, sodass sich diese Reaktionen nun in sehr hohen Ausbeuten am polymeren Träger durchführen lassen. rnSpeziell Glycosylierungsreaktionen zeigten jedoch erhebliche Kompatibilitätsprobleme mit der polymeren Matrix. Die Ausbeuten aller an der festen Phase durchgeführten Glycosylierungen lagen bei maximal 5 Prozent. rnGlycopeptidsynthesen: Einige Tumorzellen unterscheiden sich von gesunden Zellen durch ein verändertes Profil an Oberflächenglycoproteinen. So ist das membranständige Glycoprotein MUC1 in malignen Epithelzellen stark überexprimiert und zeigt infolge veränderter Aktivitäten mehrerer Glycosyltransferasen ein modifiziertes Glycosylierungsmuster. Diese tumorspezifischen Strukturveränderungen stellen einen interessanten Angriffspunkt zur Entwicklung von Antitumorvakzinen dar. Um zu potentiellen Impfstoffen zu gelangen, ist es jedoch nötig, die Immunogenität der selbst nur schwach immunogenen Glycopeptide durch Konjugation zu erhöhen. rnIm Rahmen dieser Arbeit sollten vollsynthetische Konjugate, auf Basis einer 16 Aminosäuren langen, tumorassoziierten Glycopeptidpartialstruktur aus dem MUC1, zur möglichen Verwendung als Antitumorvakzine synthetisiert werden. Die Darstellung erfolgte in einer automatisierten Festphasensynthese nach der Fmoc-Strategie. rnZur Steigerung der Immunogenität wurde das glycosylierte Hexadecapeptid über einen Spacer mit einem T-Zell-Epitop aus dem Tetanustoxoidprotein sowie mit einem Mitogen verknüpft. Zur Synthese des Mitogenkonjugates sind noch Optimierungen im Syntheseablauf und insbesondere bei der Reinigung notwendig. Die immunologische Evaluierung des MUC1-Tetanustoxin-Heterotopkonjugates als mögliches Antitumorvakzin ist geplant. rn

Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn

Modulare Synthese von Sialyl-Lewis X-Mimetika als Selektin-Liganden

Zelladhäsions- und Zellerkennungsphänomene spielen eine entscheidende Rolle im biologischen Geschehen: So findet die Kommunikation zwischen Zellen zu einem großen Teil zwischen membranständigen Adhäsionsmolekülen und ebenfalls membranständigen Liganden auf Nachbarzellen statt. Zu diesen Adhäsionsmolekülen gehören die Selektine, die von fundamentaler Bedeutung für die Bekämpfung von Entzündungskrankheiten und damit für die Funktionsweise unseres Immunsystems sind. Tritt eine Entzündung in unserem Körper auf, so sind Selektine an Adhäsionsprozessen beteiligt, die zur Auswanderung von Leukozyten aus dem Blutstrom in das entzündete Gewebe führen. Diese auswandernden Zellen enthalten eine Vielzahl von Wirkstoffen, die Krankheitserreger bekämpfen, aber auch körpereigenes Gewebe angreifen können. Viele Krankheitsbilder, die mit akut oder chronisch entzündlichen Prozessen einhergehen, hängen mit einer Dysregulation der Selektine zusammen. In diesen Fällen werden übermäßig Selektine exprimiert und es kommt zu einer lokal überschießenden Akkumulation von Leukozyten, die zu Schädigungen von gesundem Gewebe führen kann. rnZu diesen Krankheiten gehören z.B. die rheumatoide Arthritis, die myocardialen Ischämie, Psoriasis sowie Asthma und Allergien. Auch bei der Abstoßung von Transplantaten und Tumormetastasierung wurde eine Beteiligung der Selektine nachgewiesen. Eine Strategie gegen diese unerwünschten Effekte ist die selektive Inhibierung der Selektine, welche aufgrund der bedeutenden Rolle der Selektine in der Genese zahlreicher Krankheiten, von großem pharmazeutischen Interesse ist. rnIn der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung chemischer Synthesen von Verbindungen beschrieben, welche selektininhibierende Eigenschaften aufweisen sollen. Solche sog. Mimetika, die wie die natürlichen Liganden mit den Selektinen wechselwirken, sind nicht nur potenzielle Medikamente, sondern können auch durch veränderte Affinität zur Aufklärung von selektinvermittelten Zelladhäsionsprozessen dienen.rn